油菜籽萌发期抗氧化酶活性变化测试

一、核心检测指标

超氧化物歧化酶（SOD）

功能：清除超氧阴离子自由基（O₂⁻），保护细胞免受氧化损伤

测定方法：氮蓝四唑（NBT）光化还原法，通过抑制蓝色甲腙生成量计算活性（单位：U/g FW）

过氧化物酶（POD）

功能：催化H₂O₂分解，参与木质素合成以增强细胞壁抗性

测定方法：愈创木酚法，470nm波长下监测吸光度变化（单位：ΔA/min·mg prot）

过氧化氢酶（CAT）

功能：专一性分解H₂O₂为H₂O和O₂，催化效率极高

测定方法：紫外分光光度法（240nm），通过H₂O₂消耗速率计算活性（单位：μmol H₂O₂/min·mg protein）

二、实验流程设计

样品制备

取萌发期油菜籽（0-7天），液氮速冻后研磨，用预冷磷酸缓冲液（pH 7.0）提取酶液，4℃、12000g离心20分钟

蛋白浓度测定采用Bradford法（考马斯亮蓝G-250）

活性测定步骤

SOD：反应体系含Met、NBT、核黄素，光照20分钟后测定560nm吸光度，以抑制率50%为1单位

POD：反应液含愈创木酚和H₂O₂，监测470nm吸光度变化3分钟

CAT：反应体系含H₂O₂，测定240nm吸光度下降速率

数据分析

酶活性计算公式：

SOD：活性(U/g FW) = [(对照OD560-样品OD560)/对照OD560] × 稀释倍数

POD：活性 = ΔA470 × 反应体积 / (酶液用量 × 样品鲜重 × 时间)

三、关键注意事项

环境控制

萌发期需保持恒温（25±1℃）、湿度（60±5%），避免光照差异影响SOD测定

干扰排除

研磨时加入PVP（聚乙烯吡咯烷酮）去除多酚干扰

每组设3个重复，同步测定空白对照（无酶液）和最大反应管（无SOD）

趋势分析

正常萌发时，SOD和CAT活性初期升高（应对氧化应激），后期随种子老化逐渐下降；POD活性可能与细胞壁加固相关，呈现波动变化

四、典型变化规律（参考）

萌发阶段 SOD活性 POD活性 CAT活性 生理意义

0-2天 快速上升 小幅波动 显著升高 清除萌发初期ROS爆发

3-5天 峰值维持 持续升高 缓慢下降 适应氧化-还原平衡

6-7天 逐渐降低 回落稳定 急剧下降 老化导致酶蛋白变性

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